Кінетика сорбції на імуносорбенті циркулюючих імунних реактантів з крові хворих на системний червоний вовчак

Специфічна екстракорпоральна імуносорбція (ІС) патологічних (за якісними чи кількісними характеристиками) компонентів гуморальної ланки імунітету є перспективним, а в ряді випадків безальтернативним за виразністю та швидкістю досягнення результату методом лікування системного червоного вовчаку (СЧВ) [1, 10, 11]. Зважаючи на незаперечно першочергове значення антитіл до ДНК (АТ-ДНК) в патогенезі цього захворювання, найчастіше в якості ліганда для афінної сорбції використовують ДНК. Хоча практично всі автори відзначають суттєву динаміку клінічних і імунологічних показників після застосування ІС, однак питання про те, чи є отримані зміни наслідком власне селективної сорбції імунореактивних агентів, залишається дискусійним [3, 12]. Адже суттєві розбіжності між результатами експериментальних і клінічних досліджень адсорбції маркерних метаболітів неодноразово відзначалися для різних сорбуючих матеріалів [2, 9].

Мета роботи – вивчення кінетики сорбції АТ-ДНК та інших циркулюючих імунних реактантів на імуносорбенті, що містить ДНК, та неприщепленому матричному сорбенті з крові хворих на СЧВ.

Дослідження виконано при проведенні гемосорбції (ГС) 22 хворим на СЧВ ІІ або ІІІ ступеню активності (люпус-нефрит був у 18 з них), які відповідали наступним умовам: виявлення підвищеного рівня антитіл до нативної ДНК імуноферментним методом (АТ-нДНК), недостатній ефект медикаментозної терапії та згода пацієнта. Проводилося 2 сеанси ГС (апарат УАГ-01) з інтервалом 5-12 днів. Через сорбційну колонку місткістю 100 мл здійснювалася перфузія цілісної гепарінізованої (300 ОД на 1 кг маси тіла) венозної крові із швидкістю 40-60 мл/хв, тривалість перфузії – 45-60 хв. В одній групі хворих (11 осіб) колонки містили імуносорбент – активоване вугілля типу СКН чи СУГС з імобілізованою на його поверхні нативною тімусною ДНК (не менше 0,5 мг ДНК на 1 мл вугілля). У решти хворих (11 осіб) для проведення неселективної ГС (НГС) використовували неприщеплене вугілля. Обидва типи масообмінників поставлялися інститутом експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького АНУ. Рандомізація хворих, лікування та облік результатів здійснювалися в умовах подвійного сліпого методу дослідження. Утворені групи суттєво не відрізнялися за демографічними показниками, всіма класифікаційними компонентами діагнозу, лабораторними даними та дозами глюкокортикостероїдів і цитостатичних імуносупресантів, що їх отримували хворі протягом всього спостереження.

В пробах крові, відібраних безпосередньо перед початком кожного сеансу ГС, на 15-й та 30-й хвилинах перфузії перед колонкою та після неї і по закінченню процедури, визначали вміст імуноглобулінів (Ig) класів А, М, G по Mancini, циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) методом преципітації 3,75% ПЕГ-6000, рівень b₂-мікроглобуліну (b₂-МГ) методом радіоімунного аналізу, АТ-нДНК та антитіл до денатурованої ДНК (АТ-дДНК) методом твердофазного імуноферментного аналізу з кон’югованою пероксидазою на Elisa-процесорі (“Bering”, Германія), а також низькоавідних IgG-АТ-нДНК та IgG-АТ-дДНК методом рідкофазного імуноаналізу. Неспецифічну поглинальну здатність сорбентів контролювали за динамікою концентрації молекул середньої маси (МСМ), яку визначали спектрофотометрично при l=254 нм. Для оцінки кліренсових характеристик сорбентів розраховували градієнт концентрації досліджуваних метаболітів при проходженні крові через колонку на 15-й і 30-й хвилинах процедури (DС₁₅ і DС₃₀).

Результати оброблені непараметричними статистичними методами з обчисленням критеріїв Вілкоксона та Манна-Уітні.

З даних, наведених в таблиці, видно, що вже на 15-й хвилині 1-го сеансу ІС, на відміну від НГС, рівень АТ-нДНК і АТ-дДНК був суттєво нижчим за початковий. Достовірне зниження рівня цих субстратів за час проходження крові через колонку з імуносорбентом на 15-й і 30-й хвилинах свідчить про адсорбцію ним АТ-ДНК. Подібні тенденції простежувалися і під час 2-го сеансу ІС. Водночас фіксація АТ-нДНК і АТ-дДНК контрольним сорбентом була зареєстрована лише на 15-й хвилині 1-го сеансу НГС, що, очевидно, відображає неспецифічні адсорбційні можливості активованого вугілля. Однак підсумкове зниження нДНК- та дДНК-зв’язуючої активності сироватки крові після 1-ої процедури обох варіантів ГС було майже однаковим і становило відповідно 28,2% і 23,6% для ІС та 20,2% і 19,3% для НГС. Під час процедур ІС та НГС знижувався вміст в крові і низькоавідних IgG-АТ-нДНК і IgG-АТ-дДНК. Проте, якщо DС₃₀ мав позитивний знак і вказував на фіксацію антитіл в масообміннику, то на 15-й хвилині спостерігалася протилежна закономірність. Важливо відзначити, що вивільнення на колонці IgG-АТ-нДНК в цей період в основній групі було значно меншим, ніж в контрольній: DС₁₅ IgG-АТ-нДНК для 1-го та 2-го сеансів ІС складав в середньому 97,4% в порівнянні з 229% для НГС (р<0,05). Це може свідчити про адсорбцію, поряд з “десорбцією”, IgG-АТ-нДНК на ДНК-прищепленому сорбенті і на 15-й хвилині перфузії. Відсутність значущих кліренсових можливостей прищепленого та матричного вугілля стосовно імуноглобулінів, зокрема IgG (див.табл.), вказує на певну специфічність описаних вище подій. Хоча було зареєстровано зниження рівня ЦІК в процесі НГС і адсорбція їх на імуносорбенті, однак після завершення обох варіантів ГС вміст ЦІК в крові не відрізнявся від початкового. Так само не впливали на кінцевий результат фіксація b₂-МГ обома сорбентами на початку ГС /DС₁₅ для ІС – (+)12,7%, для НГС – (+)18,5%/ і вивільнення його в другій половині сеансу /DС₃₀ для ІС – (-)15,4%, для НГС – (-)49%/. Сорбція МСМ прищепленим та контрольним вугіллям була однаковою і зберігалася стабільною протягом обох сеансів перфузії: DС₁₅ коливався в межах (+)24,8 – (+)35%, DС₃₀ – (+)21,9 – (+)35,9%. В цілому ефективність 2-го сенсу ГС стосовно видалення всіх метаболітів, за винятком МСМ, була меншою, очевидно, внаслідок нижчої їх вихідної концентрації. Слід також зауважити, що при ІС DС₃₀ всіх реактантів, крім b₂-МГ, був більшим, ніж DС₁₅, а при НГС – меншим.

Таблиця. Зміна концентрації циркулюючих імунних реактантів під час імуносорбції та неселективної гемосорбції у хворих на СЧВ

Показник	Вид ГС	1-й сеанс ГС						2-й сеанс ГС
		До ГС	15-а хвилина		30-а хвилина		Після ГС	До ГС	15-а хвилина		30-а хвилина		Після ГС
			А	Б	А	Б			А	Б	А	Б
АТ-нДНК, од.	ІС	3,48	2,931	2,461,2	3,031	2,371,2	2,501	1,97	1,77	1,541,2	1,87	1,601,2	1,471
	НГС	3,31	3,40	2,961,2	2,601	2,891	2,641	2,71	2,491	2,60	2,411	2,421	2,111
АТ-дДНК, од.	ІС	2,46	2,221	2,121	2,41	2,191,2	1,881	2,06	1,98	1,901	1,721	1,731	1,661
	НГС	2,23	2,20	2,001,2	1,841	1,931	1,801	1,73	1,85	1,89	1,69	1,75	1,621
IgG-АТ-нДНК,г/л	ІС	1,00	0,401	0,932	0,531	0,241,2	0,641	0,72	0,371	0,60	0,331	0,201	0,431
	НГС	0,89	0,481	1,432	1,02	0,401,2	0,551	1,07	0,301	1,082	1,13	0,421,2	0,571
IgG-АТ-дДНК,г/л	ІС	0,81	0,70	0,77	0,641	0,411,2	0,621	0,49	0,66	0,54	0,37	0,301	0,40
	НГС	0,67	0,44	0,982	0,381	0,281	0,401	0,82	0,371	0,812	0,63	0,251,2	0,441
ЦІК, ум.од.	ІС	318	315	2612	299	1881,2	317	274	240	232	250	2071	261
	НГС	281	266	2351	296	291	302	259	243	2021	271	277	308
IgG, г/л	ІС	8,0	7,01	7,5	6,41	6,21	7,6	9,2	10,0	9,6	9,1	8,61	8,9
	НГС	9,8	9,4	9,7	8,51	7,91	9,3	8,8	9,0	8,3	8,6	8,7	7,9
IgM, г/л	ІС	0,97	1,01	1,05	0,95	0,93	1,01	0,89	0,90	0,92	0,84	0,91	0,89
	НГС	1,15	1,18	0,99	0,94	1,11	1,21	1,12	1,23	1,14	1,03	1,19	1,06
IgA, г/л	ІС	1,95	2,12	2,16	1,96	2,08	2,04	1,72	1,60	1,84	1,83	1,71	1,68
	НГС	1,77	1,73	1,83	1,68	1,73	1,64	1,57	1,53	1,67	1,64	1,74	1,77
b2-МГ, мг/л	ІС	4,61	4,80	4,191,2	5,46	6,301,2	5,39	-	-	-	-	-	-
	НГС	4,13	4,28	3,491,2	3,90	5,811,2	3,64	-	-	-	-	-	-
МСМ, ум.од.	ІС	337	331	2151,2	320	2051,2	292	296	302	2271,2	342	2481,2	323
	НГС	298	325	2171,2	272	2101,2	296	254	272	1821,2	228	1781,2	240

Примітка. А – проба крові до колонки з сорбентом, Б – після колонки; ¹ – достовірність різниці (р<0,05 -0,01) в порівнянні з початковими значеннями перед кожним сеансом ГС,   ² – в порівнянні із значеннями до колонки.

Отже, кінетика сорбції імунореагуючого матеріалу з крові хворих на СЧВ на сорбенті, що містить ДНК, має складний, неоднозначний характер і відрізняється від такої на неприщепленій вуглеродній матриці. Ці процеси, судячи із стабільності DС для МСМ, не пов’язані з теоретично можливими змінами неспецифічної поглинальної активності сорбентів внаслідок прищеплення ДНК чи “зсідання” вугілля протягом сеансу ГС. Ступінь зниження рівня АТ-нДНК на імуносорбенті та характер сорбційної кривої суттєво відрізняються від даних, отриманих для аналогічних сорбуючих матеріалів в умовах стендових випробувань [7]. Однак з урахуванням деяких технічних розбіжностей та двох принципових відмінностей – по-перше, використання в нашому дослідженні відкритого, а не закритого контуру циркуляції і, по-друге, перфузії через сорбент цілісної крові, а не плазми – отримані в лабораторних умовах та в клініці результати слід розглядати як цілком паритетні. Постійне надходження з тканин організму нових порцій антитіл та чисто механічні перешкоди для їх адсорбції з цілісної крові можуть пояснити невисокий відсоток зв’язування антитіл на імуносорбенті та помірне підсумкове зниження АТ-нДНК і АТ-дДНК. Але близький за значеннями кінцевий результат НГС за умов, коли неспецифічна фіксація високоавідних АТ-ДНК відбувалася лише на початку сеансу, передбачає існування інших механізмів змін ДНК-зв’язуючої активності крові. На це ж вказує феномен “десорбції” низькоавідних антитіл на початку перфузії. Можна припустити, що в результаті контакту Ig з активованим вугіллям, зниження рН крові [4] змінюються іонне мікрооточення та фізико-хімічні властивості антитіл, від яких значною мірою залежить їх афінність і результати лабораторного визначення антитільної активності крові [8]. На динаміку рівня АТ-ДНК, особливо низькоавідних, могли впливати руйнування ЦІК на сорбенті, утворення нових комплексів, відщеплення антитіл з поверхні імунокомпетентних клітин крові [6]. В контексті участі клітин крові в динаміці рівня гуморальних агентів можна розглядати і зміни концентрації b₂-МГ – білка, який є складовою частиною мембранних білків лімфоцитів і у великій кількості синтезується ними: на початку перфузії b₂-МГ активно поглинався сорбентом як метаболіт невисокої молекулярної маси, а пізніше, по мірі наростання ушкоджуючої дії гранул вугілля на клітини, він “продукувався” на сорбенті внаслідок альтерації чи активації лімфоцитів. Стосовно ІС слід сказати ще й про можливість специфічної адсорбції раніше активованих ДНК лімфоцитів [3,6] та важко прогнозовані наслідки екстракорпоральної презентації антигена імунокомпетентним клітинам [5,6]. Взагалі, за нашими даними[3], серед механізмів, відповідальних за терапевтичну ефективність ІС, провідна роль належить реакціям клітинного імунітету, а не самій елімінації антитіл сорбентом.

Таким чином, на ДНК-прищепленому сорбенті, на відміну від контрольного, протягом всього сеансу ГС фіксуються низько- та високоавідні АТ-ДНК і ЦІК. Найбільш активно це відбувається на 30-й хвилині перфузії. Однак кінетика сорбції та кінцева концентрація циркулюючих імунних реактантів є не відображенням односпрямованого процесу їх зв’язування сорбентом, а результатом складної взаємодії антитіл, імунних комплексів та клітин крові між собою, з вуглеродною матрицею та прищепленою ДНК на тлі постійного поповнення плазмового пула адсорбату з тканинних депо, причому питома вага цих детермінант на кожному етапі ІС та НГС різна.

ЛІТЕРАТУРА:

1. Аксенов В.А., Горбатенко В.Б., Акаемова О.Н., Селютин А.А. //Тер.архив.- 1997. - №2. – С.66-68.
2. Амон Е.П., Назаров А.В., Суханов В.А., Сенцов В.Г. //Клин.лаб.диагн. – 1998. - №3. – С.41-43.
3. Амосова Е.Н., Яременко О.Б., Снежкова Е.А., Дранник Г.В. //Тер.архив. – 1997. - №12.      – С.18-22.
4. Нетяженко В.З., Яременко О.Б. // Новые средства и сферы клиничес­кого применения сорбционной детоксикации организма/ Тез.докл.ІІІ конф. Укр.ССР. - Днепропетровск, 1985. – С.87-88.
5. Плаксин Д.Ю. //Совершенствование методов исследования иммунитета и    иммунодиагностики. – Пермь, 1982. – С.10-13.
6. Ройт А. Основы иммунологии: Пер. с англ. — М.: Мир, 1991. – 328с.
7. Снежкова Е. А., Никитин А. А., Антоненко Г. И.// Акту­альные вопросы     экстракорпоральной детоксикации орга­низма. – М. 1987. - С. 105-110.
8. Цебенцауэр Л., Поверенный А. И., Насонов Е. Л. и др. // Тер. арх. - 1987. - № 4. - С. 48-50.
9. Яременко О.Б., Тер-Вартан’ян С.Х., Лопушенко Л.Г., Михальчук Г.А. //Укр.биохим.журн. – 1994. - №3. – С.110-113.
10. Раlmer A., Gjorstrup P., Welsh K. et al. //Lancet. – 1988. – Vol.2, N 8605. – P.272.
11. Schneider M., Berning T., Waldendorf M. et al. //J.Rheumatol. – 1990. – Vol.17, N 7. – P.900-907.
12. Wallace D.J. //Dubois’lupus erythematosus/Ed. by D.J.Wallace, B.H.Hahn. – Philadelfia/London, 1993. – Chapt.60. – P.596-599.

О.Б.Яременко
КИНЕТИКА СОРБЦИИ НА ИММУНОСОРБЕНТЕ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ РЕАКТАНТОВ ИЗ КРОВИ БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКОЙ

В условиях двойного слепого метода изучено содержание в крови антител к нДНК и дДНК (АТ-нДНК и АТ-дДНК) методами твердофазного и жидкофазного иммуноанализа, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), b₂-микроглобулина (b₂-МГ), Ig G, M и A в динамике проведения двух сеансов иммуносорбции (ИС) или неселективной гемосорбции (НГС) у 22 больных системной красной волчанкой. У 11 пациентов для ИС применяли ДНК-содержащий активированный уголь, у остальных 11 для НГС – непривитой уголь. В течение всего сеанса ИС на фоне стабильной неспецифической поглотительной активности сорбента на нем фиксировались высоко- и низкоавидные АТ-нДНК и ЦИК, в меньшей степени – АТ-дДНК, причем градиент концентрации этих веществ на колонке на 30-й минуте перфузии был выше, чем на 15-й минуте. Контрольный уголь связывал АТ-нДНК и АТ-дДНК, определяемые методом ELISA, только в начале сеанса и низкоавидные АТ – на 30-й минуте. На 15-й минуте перфузии уровень низкоавидных АТ-нДНК и АТ-дДНК в крови после колонки достоверно повышался как при НГС, так и – менее существенно  – при ИС. Адсорбции Ig обоими сорбентами не зарегистрировано. Падение концентрации b₂-МГ на колонках с привитым и матричным углем в начале перфузии и рост ее во второй половине сеанса, вероятно, обусловлены изменениями структурно-функционального состояния форменных элементов крови в результате их взаимодействия с адсорбентом.