Эффективность иммуносорбции у больных системной красной волчанкой: двойное слепое контролируемое исследование

Одним из наиболее специфичных и частых проявлений иммунологических нарушений при системной красной волчанке (СКВ) является повышенное содержание в крови антител к ДНК (анти-ДНК) и ДНК-содержащих иммунных комплексов, играющих важную роль в патогенезе повреждения различных органов и тканей, в первую очередь почек [10, 20].

Традиционная медикаментозная терапия при СКВ с использованием неспецифических иммуносупрессивных агентов далеко не всегда приводит к желаемым клиническим результатам и нормализации иммунологических параметров. В связи с этим в последние два десятилетия предпринимаются настойчивые попытки повлиять на эффективность лечения путем применения экстракорпоральных эфферентных процедур, направленных на удаление из организма патогенных иммунных реактантов и повышение их естественного клиренса.

Обнадеживающие результаты, полученные при включении в комплексную терапию больных СКВ неселективной гемокарбоперфузии [1, 4, 6], дают основание рассчитывать на еще более значительный клинико-лабораторный эффект специфической иммуносорбции (ИС) со связыванием анти-ДНК на ДНК-содержащем сорбенте. Первые работы по клиническому применению ИС при СКВ [13, 18], в которых в качестве адсорбционной среды использовалась плазма, продемонстрировали перспективность этого метода. Однако дальнейшему его внедрению препятствовал ряд причин, среди которых наиболее существенными являлись сложность и высокая стоимость процедуры иммунной плазмосорбции и развитие синдрома рикошета — увеличение концентрации анти-ДНК в постсорбционном периоде [12, 17, 19]. Прогресс в развитии ИС наряду с разработкой подходов к предупреждению синдрома рикошета [17, 19] ассоциируется с максимальным упрощением технологии метода, в частности с возможностью перфузии через колонку цельной крови, пусть даже ценой потерь в специфичности [5,12].

Целью настоящей работы явилось изучение эффективности ИС, предусматривающей перфузию цельной крови через ДНК-содержащий гемосорбент, у больных СКВ в условиях двойного слепого контролируемого исследования.

Материалы и методы

Под нашим наблюдением находились 22 больных достоверной СКВ по критериям АРА (1982). Среди клинических проявлений чаще всего наблюдались поражение кожи и слизи- стых — у 22 пациентов (в том числе эритема лица в виде "бабочки" — у 15), поражение суставов — у 21, люпус-нефрит — у 18, лимфаденопатия — у 16, кардит — у 16, плеврит — у 14, алопеция — у 14, пневмонит — у II, церебральный васкулит — у 8. Критериями включения в исследование являлись высокая или умеренная активность заболевания, отсутствие стойкого эффекта от предшествующего лечения глюкокортикосте-роидами (ГКС) или ГКС в сочетании с цитостатическими им-муносупрессантами (ЦИС), повышенный уровень антител к нативной ДНК (анти-нДНК) по данным иммуноферментного анализа.

Критериями исключения были наличие хронической почечной недостаточности выше 1 стадии, общепринятых противопоказаний к проведению гемосорбции (ГС), отказ больного. Двойным слепым методом больных разделили на 2 группы по 11 человек в каждой. В основной группе пациентам проводили по 2 сеанса ИС с интервалом 5—12 дней (в среднем 9 дней), в контрольной — по 2 сеанса неселективной ГС (НГС) с таким же интервалом. По основным демографическим и клиническим параметрам группы были сопоставимы (табл. 1).

Таблица 1
Сравнительная характеристика больных СКВ, в лечении которых использовали ИС и НГС

Все больные получали ГКС (преднизолон в суточной дозе 25— 80 мг), а 7 больных основной группы и 6 — контрольной — дополнительно ЦИС (циклофосфамид по 200 мг внутримышечно через день или азатиоприн по 100—150 мг/сут). В дни проведения ГС с заместительной целью дозы этих препаратов повышали в среднем на 50—70%.

Процедуры ГС проводили по вено-венозному контуру с использованием аппарата УАГ-01. Средняя скорость перфузии составляла 40—60 мл/мин, длительность перфузии — до 60 мин. Гепаринизацию осуществляли с учетом времени свертывания крови, в среднем из расчета 300 ЕД гепарина на 1 кг массы тела. В качестве иммуносорбента применяли активированный уголь типа СКН или СУГС с иммобилизованной на его поверхности нативной тимусной ДНК (не менее 0,5 мг ДНК на 1 мл угля). Для НГС использовали непривитые угли той же марки. Объем сорбционных колонок — 100 мл. Оба типа сорбентов поставлялись Институтом экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого АН Украины.

Помимо рутинного клинико-лабораторного обследования, у больных определяли содержание в крови сывороточных иммуноглобулинов (Ig) классов А, М, G методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) методом осаждения в 3,75% полиэтиленгликоле, общую активность комплемента по 50% гемолизу эритроцитов барана (СН50), уровень анти-нДНК и антител к денатурированной ДНК (анти-дДНК) иммуноферментным методом с конъюгированной пероксидазой на ELISA-процессоре ("Веring", ФРГ), а также уровень низкоавидных IgG-анти-нДНК и IgG- анти-дДНК методом жидкофазного иммуноанализа [3]. Исследование состояния клеточного иммунитета включало определение количества Т-лимфоцитов (Е-РОК), В-лимфоцитов (ЕАС-РОК), супрессорных и хелперных субпопуляций — теофиллинчувствительных (Етфч- РОК) и теофиллинрезистентных (Етфр-РОК) Т-лимфоцитов в тестах розеткообразования, функциональной активности лимфоцитов в реакции бластной трансформации (РБТ), стимулированной поликлональными Т-и В-клеточными митогенами — ФГА, КонА и митогеном лаконоса (МЛ) с оценкой пролиферативного ответа по включению 3Н-тимидина.

Индекс стимуляции клеток рассчитывали путем вычисления частного от деления количества импульсов в минуту в стимулированных митогенами культурах на аналогичную величину в контрольных культурах. О фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) судили по величинам фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса (объектом фагоцитоза служили частицы латекса) и результатам теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).

Оценку иммунного статуса проводили до 1-го сеанса ГС, на 2—4-е и 6— 10-е сутки после него и на 2—7-е сутки после 2-го сеанса. Кроме того, для анализа кинетики сорбции анти- нДНК и анти-дДНК брали кровь непосредственно перед началом каждого сеанса ГС, на 15-й и 30-й минуте до и после колонки с сорбентом и после окончания процедуры. В этих же пробах крови с целью контроля возможного процесса "спекания" сорбента с уменьшением его неспецифической поглотительной емкости определяли содержание молекул средней массы (МСМ) экспресс-методом [2] при длине волны 254 нм.
Статистическую обработку данных проводили непараметрическими методами с вычислением парного критерия Вилкоксона и критерия Уайта. Различия считали достоверными при р < 0,05.

Результаты

В первые дни после 1-го сеанса ГС отчетливый положительный эффект в виде уменьшения артралгий, миалгий, одышки, нормализации температуры тела, снижения СОЭ и уровня С-реактивного белка отмечался только у 1 пациента из каждой группы. У 4 больных после ИС и у 5— после НГС на 2—3-и сутки появлялись или усугублялись кожная сыпь, артрит, лимфаденопатия, повышалась температура тела. У 7 из 9 этих пациентов была III степень активности СКВ. Наиболее выраженные обострения развивались в тех случаях, когда предшествующее лечение ГКС было, вероятно, недостаточно интенсивным. По крайней мере ни у одного из 3 больных, которым за 7—12 дней до ГС проводили пульс- терапию метилпреднизолоном (в 1 случае в сочетании с циклофосфамидом), ухудшения состояния не отмечалось. Положительная динамика клинических и лабораторных данных, характеризующих общую активность воспалительного процесса, наблюдалась в обеих группах (у 9 больных после ИС и у 7— после НГС) сравнительно поздно — через 1—2 нед после 2-го сеанса ГС. Следует отметить, что у большинства пациентов (8 — из основной и 7 — из контрольной группы) после начала гемоперфузионной терапии повышали дозы ГКС и ЦИС, включая проведение пульс-терапии (соответственно 6 и 5 больным).

В отличие от столь неубедительного влияния ГС на общую активность заболевания в обеих группах ИС оказывала отчетливое положительное действие на течение люпус- нефрита. Уже начиная с 1-й недели после 1-го сеанса ИС у 9 из 10 больных с поражением почек уменьшалась лейкоцит-и эритроцитурия, увеличивался диурез, а после 2-го сеанса у 8 пациентов снижалась суточная протеинурия в среднем на 40,8% (с 3,77 до 2,23 г, р < 0,01). В 3 случаях содержание белка в суточной моче уменьшилось в 3—4,2 раза. У 2 больных с нефротическим синдромом благоприятного результата достичь не удалось. В контрольной группе улучшение анализов мочи отмечалось лишь у 2 из 8 больных с нефритом. Уровень суточной протеинурии до курса НГС составил в среднем 4,12 г, после - 3,91 г (р > 0,05). Переносимость ИС и НГС в большинстве случаев (у 7 больных основной группы и 8 — контрольной) была удовлетворительной. Наблюдавшиеся осложнения в виде ознобов, нагноения катетера, гематом купировали традиционными средствами.

Результаты исследования кинетики сорбции анти-нДНК, представленные на рисунке, свидетельствуют о том, что достигнутое к концу 1-го сеанса ИС снижение уровня антител (на 28% от исходного) являлось результатом их адсорбции на колонке. При НГС ДНК- связывающая активность крови также уменьшалась (на 20%), однако фиксация антител на сорбенте имела место лишь в начале перфузии. На это указывают величины градиента концентрации (?С) анти-нДНК на 15-й и 30-й минутах процедуры: в основной группе они составили +0,5 и +0,7 ед., а в контрольной — +0,4 и —0,3 ед. Обращает на себя внимание динамика уровня анти-нДНК (в ед.) при проведении ИС и НГС.

А — проба до колонки с сорбентом, Б — после колонки. Звездочка — различия по сравнению с исходными значениями перед каждым сеансом достоверны. Факт существенного снижения уровня антител в период между 1-м и 2-м сеансами ИС (на 21%, р < 0,05), чего не наблюдалось при НГС. Сорбционная кривая 2-го сеанса ИС была сходной с таковой 1-го сеанса. Что же касается НГС, то ни на 15-й, ни на 30-й минутах 2-й процедуры адсорбции анти-нДНК на массообменнике не зарегистрировано. После окончания 2-го сеанса ГС уровень анти-нДНК в основной группе был ниже исходного (до 1-й процедуры ГС) на 53,6%, а в контрольной — на 36,4% (р < 0,05). При анализе кинетики сорбции анти-дДНК обнаружены в целом те же закономерности, что и для анти-нДНК, хотя на всех этапах лечения изменения были менее выраженными. Неспецифическая по- глотительная емкость обоих сорбентов существенно не изменялась: ?С для МСМ на 15-й и 30-й минутах колебался в пределах (+)23 — (+)34%.

При динамическом наблюдении выявлено более благоприятное воздействие ИС на иммунный статус больных (табл. 2). Уже после 1-го сеанса ИС повышалась активность комплемента и снижалось содержание IgG-анти-нДНК, а к концу лечения, кроме того, уменьшалась концентрация ЦИК. Эти данные наряду со снижением уровня IgG могут указывать на подавление активности В-клеточного звена иммунитета и уменьшение вы- раженности иммунокомплексной аутоагрессии у больных основной группы. На фоне применения НГС подобных изменений не наблюдалось, более того, после 2-го сеанса уровень IgG-анти-нДНК оказался в 2,2 раза выше исходного.

Выявленные различия подтверждались и при оценке состояния клеточного иммунитета. На фоне неизмененного общего количества и пролиферативного потенциала Е-РОК, оцениваемого по РБТ с ФГА, в обеих группах происходили однотипные изменения субпопуляций Т-клеток с хелперными и супрессорными свойствами. При этом в основной группе процентное и абсолютное содержание ЕАС-РОК и показатели РБТ с МЛ снижались, а в контрольной — возрастали.

Динамика показателей ФАН в обеих группах отличалась значительной неоднородностью и зависела от исходного состояния. По средним же значениям отмечено стимулирующее влияние ИС и НГС на активность фагоцитоза, наиболее четко выраженное, судя по фагоцитарному числу и показателю НСТ-теста, на 2—4-е сутки после 1-го сеанса.

Таким образом, под влиянием курсового лечения с применением ИС происходило существенное снижение уровня как высоко-, так и низкоавидных анти-ДНК, ЦИК, IgG, повышение активности комплемента. При этом основные различия между сравниваемыми группами в динамике титра антител выявлялись не столько во время гемоперфузии, сколько в межсорбционном периоде и после 2-го сеанса ГС, что связано с противоположно направленными изменениями количества и функциональной активности В-лимфоцитов — их уменьшением после ИС и увеличением после НГС.

Отличительной особенностью ИС является ее благоприятное воздействие на проявления волчаночного нефрита. Такой эффект может быть обусловлен снижением уровня анти-ДНК, ЦИК в крови, активацией макрофагальной системы, стромальных клеток и элиминацией из почечной ткани депозитов иммунных комплексов и Ig, принципиальная возможность которой продемонстрирована в клинике и эксперименте [11,18].

Достигнутое в результате 1-го сеанса ИС уменьшение уровня анти-нДНК (на 28%) существенно отличается от величин клиренса, полученных в стендовых испытаниях ДНК- содержащих сорбентов — 50—90% [9,21] и при их применении в клинических условиях другими авторами — 85—90% [13,18].

Данное различие, помимо ряда других методических причин (использование в упомянутых работах носителей с большим суммарным количе- ством иммобилизованной ДНК, больших объемов перфузии, включение в контур дополнительных фильтров и др.), может быть связано еще и с тем, что в нашем исследовании через колонку перфузировалась не плазма, а цельная кровь. Вследствие этого эффективность сорбции оказалась не столь высокой, однако сам феномен специфического связывания антител на иммуносорбенте имел место у всех больных и регистрировался на 15- й и 30-й минутах обоих сеансов ИС. Близкое по значениям снижение нДНК-связывающей активности крови во время НГС являлось, возможно, следствием неспецифической адсорбции антител углеродной поверхностью [9], особенно на начальных этапах перфузии, а также результатом изменения физико-химических свойств Ig при непосредственном контакте с гранулами угля, что могло временно ухудшить выявляемость анти-нДНК [7,10].

Одним из наиболее серьезных нежелательных эффектов, наблюдаемых через 1—2 нед после селективной иммунной плазмосорбции, считается активация синтеза антител той же специфичности [12,15,19]. Мы не наблюдали подобного иммунного рикошета, более того, в период между сеансами ИС уровень анти-нДНК продолжал снижаться. Предположительно это может быть связано с менее значительной по сравнению с плазмосорбцией элиминацией анти-нДНК, индуцировавшей менее выраженный В-клеточный ответ, для сдерживания которого оказалась достаточной проводившаяся интенсивная терапия ГКС и ЦИС. Нельзя исключить и процесс специфической сорбции на ДНК-содержащем сорбенте примированных этим антигеном В-лимфоцитов, на поверхности которых, как известно, экспрессировано большое количество соответствующих антител [8, 16]. Некоторое значение могло иметь неспецифическое иммуноприлипание иммунокомпетентных клеток, в числе прочих форменных элементов крови, в результате взаимодействия их поверхностных Fc- и С3-рецепторов со сформированными на иммуносорбенте иммунными комплексами [14, 16].

Пополнение же клона антителопродуцирующих клеток в определенной мере подавлялось назначавшимися антимитотическими препаратами.

Различия между основной и контрольной группами в постсорбционном периоде также можно объяснить обновлением при ИС популяции В-лимфоцитов с более эффективным воздействием иммуносупрессантов на молодые клетки, проходящие стадии дифференцировки и пролиферации.

Таким образом, ИС, предусматривающая перфузию цельной крови через ДНК-привитой гемосорбент, является эффективным дополнительным методом лечения больных СКВ с люпус-нефритом. Обязательным условием безопасности и результативности этого метода следует считать интенсивную терапию ГКС и ЦИС, включая применение ударных доз препаратов до и сразу после 1-го сеанса ИС. Конечный результат лечения определяется не столько элиминацией анти-ДНК во время гемоперфузии, сколько благоприятной перестройкой клеточного звена иммунитета.

ЛИТЕРАТУРА

1. Веналис А. И., Матулис А. А., Барейкене И. П. и др. // Тер. арх. - 1989. - № 5 - С. 6-10.
2. Габриелян Н. И., Левицкий Э. Р., Щербанева О. И. и др. // Там же. - 1983. - № 6. - С. 76-78.
3. A.c. 1196005 СССР. Способ определения иммуноглобулин-антител в биологических объектах / Грицюк А. И., Федорич В. Н., Гаевская А. В., Бульда И. Д. // Открытия. — 1985. - № 45.- С. 15.
4. Дмитриев А. А. Гемосорбция в комплексном лечении системных ревматических и близких к ним заболеваний: Автореф, дис.... д-ра мед. наук. — М., 1984.
5. Кулаев Д. В., Андрианова И. П., Гусев С. А. и др. // Пат. физиол. - 1988. - № 4. - С. 38-41.
6. Лысенко Г. И. 11 Наука и практика — здравоохранению. — Киев, 1991. - Ч.3.- С. 130-132.
7. Насонов Е. Л., Дмитриев А. А., Петрова Г. Н. и др. // Тер. арх. - 1982. - № 7. - С. 103-107.
8. Ройт А. Основы иммунологии: Пер. с англ. — М., 1991.
9. Снежкова Е. А., Никитин А. А., Антоненко Г. И. // Актуальные вопросы экстракорпоральной детоксикации организма. - М„ 1987. - С. 105-110.
10. Цебенцауэр Л., Поверенный А. И., Насонов Е. Л. и др. // Тер. арх. - 1987. - № 4. - С. 48-50.
11. Цыпин А. Б., Насонова В. А., Ведерникова Л. А. и др. // Бюл. экспер, биол. - 1988. - № 6. - С. 703-705.
12. Чучалин А. Г., Лебедин Ю. С., Раудла Л. А. // Вестн. АМН СССР. - 1990. - № 3. - С. 44-48.
13. El Habib R., Laville M., Traeger J. et al. // Artif. Organs. — 1984. - Vol. 8, N 1.- P. 122.
14. Fornusek L., Vetvicka V. // Folia microbiol. — 1984. — Vol. 29, N 6.- P. 476-516.
15. Kanai К., Nakajima Т., Morioka S. et al.// Therapeutic Plasmapheresis (1). — Stuttgart, 1981. — P. 227—232.
16. Langvad Е., Hyden H., Wolf Н., Kroeigaard N. // Brit. J. Cancer. - 1975. - Vol. 32, N 6.- P. 680- 692.
17. Terman D. S., Garcia-Rinaldi R., Danneman B.et al.// Clin. exp. Immunol. - 1978. - Vol. 34. - P. 32-41.
18. Terman D. S.. Buffaloe G., Mattioli C.et al.// Lancet. — 1979. - Vol. 2, N 8147. - P. 824-827.
19. Terman D. S. // Plasma Ther. Transfus. Technol. — 1983. — Vol. 4, N 4.- P. 415-433.
20. Tsai Ch.-Y., Wu T.-H., Sun K.-H. et al. // Ann. Rheum. Dis. - 1992. - Vol. 51, N 2.- P. 162-167.
21. Yokohari R., Aotsuka S., Okawa M. et al. // Therapeutic Plasmapheresis (II). - Stuttgart, 1982. - P. 123-125.

EFFICACY OF IMMUNOSORPTION IN PATIENTS WITH SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS: A DOUBLE BLIND CONTROLLED TRIAL
E. N. Amosova, 0. B. Yaremenko. E. A. Snezhkova, G. V. Drannik

Summary

Efficacy of immunosorption (IS) employing perfusion of whole blood through activated charcoal containing DNA was studied in 11 patients with systemic lupus erythematosus (SLE). 11 SLE patients exposed to hemosorption on charcoal free from DNA served as controls. When used in combination with intensive therapy (corticosteroids and cytostatic immunosuppressant), IS produced a posi-tive effect on lupus nephritis symptoms in 8 out of 10 patients with kidney affection. AntiDNA antibodies blood level decreased by 53.6% after two IS procedures, while only by 36.4% after nonselec-tive hemosorption. Reduced count and functional activity of B-cells recorded after IS contribute much to final outcome of the treat-ment. Key words: SLE, immunosorption, lupus nephritis, combined therapy, immune status.