Функціональний стан клітинних мембран у хворих на ревматоїдний артрит

Патогенез та клінічні прояви ревматоїдного артриту (РА) значною мірою визначаються порушеннями метаболізму як в тканинах суглобів, так і в організмі в цілому [4, 5]. Провідна роль в формуванні певного метаболічного статусу та структурних змінах будь-яких клітин та тканин належить цитоплазматичним мембранам, від стану білкової та ліпідної складової яких залежать рецепторна функція, активність та вибірковість трансмембранного транспорту речовин, енергетичний баланс, тривалість життя клітин[1, 6]. Наявність вже починаючи з ранніх стадій РА таких патогенетичних факторів як активація вільнорадикального окислення (ВРО) [10, 13], протеазної системи [3, 14], “первинні” та індуковані лікуванням порушення кишечного травлення [8, 9, 12] передбачає багатокомпонентну ушкоджуючу дію на мембранні структури. Однак роботи, присвячені цьому питанню, обмежуються зазвичай характеристикою лише деяких аспектів альтеративних процесів – найчастіше перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) – і не дають повної уяви про їх спектр на різних стадіях та при різних формах хвороби, а також про викликані ними зміни структурно-функціонального стану клітинних мембран. Між тим саме останні, насамперед порушення мікров’язкості та проникності, а не сам факт підвищення генерації активних форм кисню чи протеолітичного потенціалу крові можуть розглядатися як критерії тяжкості патологічного процесу та ефективності лікувальних заходів [6, 11, 15].

Метою нашого дослідження був комплексний аналіз стану ВРО, деградації мембранних білків, жирнокислотного складу фосфоліпідів та проникності мембран еритроцитів артеріальної та венозної крові у хворих з різними клінічними варіантами перебігу РА.

Матеріал та методи дослідження

Обстежено 119 хворих на РА (98 жінок та 21 чоловік) у віці від 14 до 71 року з І (7 хворих), П (41) та Ш (71) ступенем активності запального процесу. У 82 (68,9%) хворих був РФ-позитивний варіант, у переважної більшості (78,2%) – повільно прогресуючий перебіг РА. Системні прояви захворювання спостерігалися у 48 хворих, з них у 27 мала місце суглобово- вісцеральна форма. За тривалістю хвороби обстежені розподілилися таким чином: до року – 16 пацієнтів, 1-5 років – 26, 6-10 років –26, 11-15 років – 32, 16-26 років – 19. У всіх хворих з “раннім” РА та вісцеритами діагноз було підтверджено в катамнезі.

Для оцінки стану ВРО вивчали три основні його ланки: процес генерації активних форм кисню (АФК), інтенсивність ПОЛ та систему антиоксидантного захисту (АОЗ). Активність продукції АФК в інтактних умовах та після додавання 3% розчину Н2О2 досліджували на хемілюмінометрі ПХЛ-01, використовуючи в якості детектора надслабкого світіння ФЭУ-25. При цьому аналізували рівень спонтанного світіння, світлосуму швидкого спалаху (Smax), світлосуму світіння протягом 5 хвилин після додавання індуктора хемілюмінесценції (S5) та час зниження амплітуди швидкого спалаху на 50% (Т1/2), який певною мірою характеризує потенціал системи АОЗ. Інтенсивність ПОЛ оцінювали за накопиченням в еритроцитах вторинних тіобарбітурат-активних продуктів (ТБК-АП) за умов неініційованої (НІ) та НАДФ?Н – індукованої (І) ліпопероксидації (Стальная И.Д., Гаришвили Г.Г., 1977). Активність каталази (АК) визначали за методом М.А. Королюк та співавт. (1988). В якості маркера ушкодження білкового компонента мембран розглядали сироватковий рівень продукту катаболізму клітинних рецепторів – R-білків, які визначали у 35 хворих з використанням специфічних антисироваток (Кульберг А.Я., Бакунц Г.О., 1989). Рівень R- білків характеризували величиною десятичного логарифму кінцевого розведення сироватки, в якому вони виявлялись. Визначення вмісту неестерифікованого холестерину (ХС) в еритроцитарних мембранах та аналіз жирнокислотного спектру фосфоліпідів проводили методом газової хроматографії з подальшим вирахуванням відносного сумарного вмісту насичених, ненасичених та поліненасичених жирних кислот (НЖК, НеЖК, ПНЖК). Неселективну проникність клітинних мембран оцінювали за часом сечовинного гемолізу еритроцитів (ЧГЕ) згідно методу В.Н.Колмакова, В.Г.Радченко (1982). Всі дослідження виконано в пробах артеріальної (/а/) та венозної (/в/) крові, отриманих шляхом пункції стегнових судин. Контрольну групу склали 16 здорових осіб у віці від 16 до 62 років.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

В цілому для РА характерними виявилися суттєва активація утворення АФК, про що свідчило зростання в загальній групі хворих Smax /в/ та S5 /в/ відповідно в 2,7 і 1,6 рази порівняно з нормою, та помірне послаблення системи АОЗ, на що вказувало зниження АК /в/ на 20,8% (р<0,05) та деяке зростання Т1/2 /в/ (на 33,4%, р>0,05). Слід відзначити формування від’ємної, в протилежність контрольній групі, артеріо-венозної різниці показника Smax (Smax /а/ = 109,5?19,5 в.о., Smax /в/ = 183,5?30,7 в.о., р<0,05), що підкреслює визначальний внесок запалених суглобів в стимуляцію процесів ВРО і свідчить про високу реактивність та достатню потужність системи АОЗ організму в цілому, на відміну від місцевих факторів АОЗ. Наслідком дисбалансу систем ВРО – АОЗ була інтенсифікація ПОЛ з вірогідним підвищенням вмісту ТБК-АП /а/ та ТБК-АП /в/ як за умов неініційованої, так і НАДФ?Н- індукованої пероксидації на 42,5-121,7%. В фосфоліпідах мембран еритроцитів з обох судинних басейнів підвищувався вміст НЖК за рахунок пальмітинової (С16:0) та стеаринової кислот (С18:0) і знижувався вміст НеЖК та ПНЖК переважно за рахунок лінолевої (С18:2) та олеїнової (С18:1) кислот при одночасному зменшенні рівня вільного ХС на 39,3-41,4% (р<0,05). Про активацію мембранодеструктивних процесів свідчило також підвищення рівня R-білків /а/ на 16,9% (р<0,05) та погіршення проникності еритроцитарних мембран (зростання ЧГЕ /а/ на 83,5%, ЧГЕ /в/ на 103,5%, р<0,001).

Порівняльна оцінка досліджуваних параметрів у хворих з різною активністю запалення (див. табл.) показала, що прямої залежності між вираженістю порушень в системах ВРО та АОЗ, ліпідним складом мембран та ступенем активності РА немає. Найбільша стимуляція продукції АФК з підвищенням більш ніж удвічі (в обох судинних басейнах) концентрації вторинних продуктів ПОЛ та зниження вмісту ХС в еритроцитарних мембранах спостерігалися у хворих з П ст. акт. РА, причому тільки в цій групі формувалась достовірна додатна артеріо-венозна різниця рівня ХС та від’ємна – Smax. При максимальній активності запального процесу зміни деяких показників (ТБК-АП НІ /а/, Smax /в/, ХС /в/, ПНЖК /а/) виявилися навіть меншими порівняно з П ст. акт. Це може бути пов’язано із зростанням внаслідок блокади мікроциркуляції відносної “закритості” вогнищ запалення при Ш ст. акт. РА і збільшенням анатомічного та функціонального артеріо-венозного шунтування крові, а також із активнішим надходженням в циркуляцію молодих еритроцитів. Незважаючи на однаковий ступінь порушень насиченості ліпідного комплексу мембран еритроцитів, їх проникність при І ст. акт. майже не відрізнялась від норми, а при П та Ш ст. акт. значно зменшувалась (ЧГЕ зростав порівняно з контролем в 1,7-2,1 рази). Очевидно, ця відмінність була наслідком дехолестеринізації мембран. Як відомо, зниження вмісту ХС, в тому числі за рахунок окислення по вільнорадикальному механізму, та/чи порушення його співвідношення з НеЖК, особливо ПНЖК, суттєво змінює площу, жорсткість, селективну та неселективну проникність клітинних мембран [1, 2, 7]. Можливо, певну самостійну чи модифікуючу роль відігравало і ушкодження мембранних білків, про наявність якого свідчило зростання концентрації R-білків в артеріальній та венозній крові. Звертає на себе увагу той факт, що рівень цього метаболіту в артеріальній крові при всіх ступенях активності був підвищеним як порівняно з контролем, так і порівняно з венозною кров’ю, де достовірні зміни виявлялись тільки при Ш ст. акт. Це вказує на генералізований характер мембранодеструктивних процесів навіть за мінімальної активності РА та наводить на думку про те, що головним джерелом надходження R-білків в кров є тканини внутрішніх органів. На користь такого припущення свідчать і результати порівняння концентрації R-білків у хворих з різними формами РА: як видно з наведених в таблиці даних, при суглобово-вісцеральній формі їх рівень був максимальним і перевищував такий при суглобовій на 12,1% в артеріальній та на 14,7% в венозній крові (р<0,05). В цілому для хворих з вісцеритами характерна відсутність артеріо-венозної різниці величин досліджуваних показників, що пояснюється їх односпрямованими змінами в крові, що відтікає від кінцівок та від внутрішніх органів. Показово, що у хворих на РА без системних проявів потужність швидкого спалаху хемілюмінограми (Smax) в периферічній венозній крові була майже в 2,5 рази більшою, ніж в артеріальній. Найбільший ступінь ушкодження клітинних мембран спостерігався у хворих з системними проявами РА без вісцеритів. В цій групі відносний вміст НеЖК в мембранних фосфоліпідах артеріальних еритроцитів був на 12,8% нижчим, ніж при суглобовій формі (р>0,05) і на 21,8% нижчим, ніж при суглобово-вісцеральній (р<0,05), головним чином за рахунок С18:2. Зміни жирнокислотної формули та одночасне значне зменшення рівня неестерифікованого ХС (в 2,2 рази порівняно з контролем, р<0,05) сприяли підвищенню мікров’язкості та погіршенню проникності еритроцитарних мембран, на що вказує зростання ЧГЕ /а/ на 161% порівняно з контрольною групою (р<0,001) та на 52% порівняно з суглобовою формою РА (р<0,05). Максимальна вираженість альтерації мембран еритроцитів у цієї категорії хворих зумовлена, очевидно, розповсюдженим екстраартикулярним периферічним васкулітом, тобто збільшенням експозиції патологічного впливу на циркулюючі клітини крові.

При розподілі обстежених на групи в залежності від тривалості хвороби знайдено, що найбільші мембранодеструктивні зміни мають місце у хворих з так званим “раннім” РА (до одного року) в еритроцитах артеріальної крові. Так, продукція АФК за інтактних умов (спонтанне світіння хемілюмінограми) у них була вірогідно підвищена на 53,7% порівняно з нормою та на 12-48% порівняно з групами з більшою тривалістю захворювання, а концентрація вторинних продуктів ПОЛ – на 28,7% порівняно з 6-10-річним стажем РА (р<0,05). Рівень мембранного ХС у цих хворих виявився найнижчим, частка НеЖК в фосфоліпідах знизилась аж до 33,0?2,5%, а ПНЖК – до 13,4?1,9%, що в середньому вдвічі нижче, ніж в наступні роки. Необхідно зазначити, що за ступенем активності та клінічною формою хвороби склад групи хворих з “раннім” РА не відрізнявся від решти груп. На нашу думку, така досить несподівана хронологічна закономірність є одним з проявів відмінності гострого чи підгострого запалення від хронічного: для першого типові вазоплегічні реакції з інтенсифікацією перфузії вогнища запалення і максимальною мобілізацією деструктивних систем швидкого реагування, включаючи ВРО, в той час як для другого характерний високий ступінь автономізації завдяки формуванню сполучнотканинно-клітинного бар’єру.

Наявність чи відсутність ревматоїдного фактору в контексті явищ, що розглядаються, самостійного значення не мали, позаяк значно більший ступінь ушкодження мембран у РФ- негативних хворих виявився наслідком суттєвого переважання серед них пацієнтів з тривалістю РА до року (в 3,4 рази порівняно з РФ-позитивними хворими; ?2=15,11, р<0,001).

Порівняння результатів обстеження цих двох груп хворих досить переконливо ілюструє вплив змін жирнокислотної формули мембранних фосфоліпідів на фізико-хімічні властивості клітинних мембран: за умов практично однакового вмісту вільного ХС у РФ-позитивних хворих відношення НЖК/ПНЖК становило 1,74, а у РФ-негативних – 4,28 (в нормі – 1,64) і при цьому проникність еритроцитарних мембран, судячи з ЧГЕ, у останньої категорії хворих була майже на 50% нижчою (р<0,05).

Отже, у всіх категорій хворих на РА має місце ушкодження ліпідного та білкового компонентів клітинних мембран. Це проявляється підвищенням в крові концентрації рецепторних білків, дисбалансом в жирнокислотній формулі фосфоліпідів із зростанням відносного вмісту насичених кислот та значним зниженням рівня вільного ХС в еритроцитарних мембранах, що приводить до суттєвого зменшення проникності останніх.

Одним з головних мембранодеструктивних чинників може бути підвищена генерація АФК та активація ПОЛ, однак прямої залежності між ступенем змін показників хемілюмінограми та концентрації вторинних метаболітів ПОЛ, з одного боку, і порушенням складу фосфоліпідів мембран та їх проникністю, з іншого боку, виявити в більшості випадків не вдається.

Найбільші відхилення показників функціонального стану мембран виявляються у хворих з тривалістю РА до одного року, П ступенем активності та системними проявами хвороби без уражень внутрішніх органів, що, очевидно, пов’язано з особливостями перебігу гострих і хронічних запальних процесів та специфікою змін мікрогемодинаміки при різних ступенях генералізації запалення. Значно більш інформативним об’єктом для досліджень таких швидкоплинних реакцій, як ВРО та залежні від нього явища є артеріальна кров, де акумулюються наслідки мембранодеструктивних процесів не тільки в одній групі суглобів, а й в усьому опорно-руховому апараті та внутрішніх органах.

ЛІТЕРАТУРА

1. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. – СПб: Питер Пресс, 1995. – 304 с.
2. Мингазетдинова Л.Н., Закирова А.Н., Ланкин В.З. Роль перекисей липидов и гемореологических расстройств в патогенезе и клиническом течении ишемической болезни сердца // Тер. архив. – 1993. - № 8. – С. 12-15.
3. Руденко В.Г., Руденко Ю.В. Протеолитические ферменты и их ингибиторы при артритах // Ревматология. – 1990. - №4. – С. 42-50.
4. Сорока Н.Ф. Клинико-биохимические аспекты ревматоидного артрита и пути оптимизации лечения: Автореф. дис… д-ра мед. наук: 14.00.39 / НИИ ревмат. – М., 1992. – 40 с.
5. Baumann H., Gauldie J. The acute phase response // Immunol. Today. – 1994. – N 2.- P. 74-80.
6. Buttke T.M., Sandstrom P.A. Oxidative stress as a mediator of apoptosis // Immunol. Today. – 1994. – Vol. 15, N 1. – P. 7-10.
7. Elghetany M.T., Hundall S.D. Spurious automated white cell count with coulter STKS in the myelodysplastic syndromes suggests the presence of a red cell membrane defect // Amer. J. Hemat. – 1996. – Vol. 52, N 1. – P. 69.
8. Endotoxinbestimmung bеі еntzundlich-reumatischen Erkrankungen - Dеr Еinfluss nichtsteroidaler Аntiphlogistica аuf dіе Dаrmреrmеаbilitat / J. Вusch, M. Наttеr, R. Вrunkhоrst, P. Waganer // Z. Rheumatol. - 1988. – B. 47, № 3. – S. 156-160.
9. Intestinal flora and disease activity in rheumatoid arthritis during vegan diet / Eerola E., Peltonen R., Nenonen M. et al. // Rheumatology in Europe. – 1995. – Vol. 24, N 3, Suppl. – P. 83.
10. Jasin H.E. Oxidative modification of inflammatory synovial fluid immunoglobulin G // Inflammation. – 1993. – Vol. 17, N 2. – P. 167-182.
11. Jourd’Heuil D., Vaananen P., Meddings J.B. Lipid peroxidation of the brush-border membrane: membrane physical properties and glucose transport // Amer. J. Physiol. – 1993. – Vol. 264, N 6 p. 3. – P. G1009-G1015.
12. Mechanisms of acute and chronic intestinal inflammation induced by indomethacin / Yamada T., Deitch E., Specian R.D. et al. // Inflammation. – 1993. – Vol. 17, N 6. – P. 641-662.
13. Miesel R., Zuber M. Copper-dependent antioxidase defenses in inflammatory and autoimmune rheumatic diseases // Inflammation. – 1993. – Vol. 17, N 3. – P. 283-294.
14. Opdenakker G., Van Damme J. Cytokine-regulated proteases in autoimmune diseases // Immunol. Today. – 1994. – Vol. 15, N 3. – P. 103-106.
15. Rengstrom J., Nilsson J. Lipid oxidation and inflammation-induced intimal fibrosis // J. Lab. Clin. Med. – 1994. – Vol. 116. – P. 162-168.

РЕЗЮМЕ

В результате обследования 119 больных ревматоидным артритом (РА) выявлено повреждение липидного и белкового компонентов клеточных мембран в артериальной и венозной крови. Это проявлялось повышением концентрации в крови продуктов деградации рецепторных белков, дисбалансом в жирнокислотной формуле мембранных фосфолипидов с повышением содержания насыщенных кислот и снижением уровня свободного холестерина в эритроцитарных мембранах, что сопровождалось уменьшением их проницаемости для мочевины на 84-104%. Одним из главных мембранодеструктивных факторов могла быть повышенная генерация активных форм кислорода и стимуляция перекисного окисления липидов, хотя прямой зависимости между изменениями этих параметров и степенью повреждения мембран эритроцитов не обнаружено. Наиболее выраженное повреждение мембран выявлялось при длительности болезни менее одного года, средней степени активности воспаления и системных проявлениях РА без поражения внутренних органов.